使基因过表达的方法（基因过表达载体构建基本步骤）



1、使基因过表达的方法

使基因过表达的方法

转染质粒

1. 稳定转染：将外源基因克隆到质粒载体中，再通过转染媒介将质粒导入细胞。质粒整合到细胞染色体中，从而使外源基因得到持续表达。

2. 瞬时转染：将外源基因克隆到质粒中，通过转染媒介将质粒导入细胞。外源基因不会整合到细胞染色体中，只在转染后一定时间内表达。

病毒载体

1. 逆转录病毒：将外源基因克隆到逆转录病毒载体中，该载体含有包装信号和LTR序列。病毒感染细胞后，将外源基因整合到细胞染色体中，从而使外源基因得到持续表达。

2. 慢病毒：与逆转录病毒类似，但慢病毒的复制需要辅助病毒，因此其整合效率和特异性更高。

转录激活因子

1. 锌指核酸酶（ZFNs）：一种人工合成的核酸酶，可以特异性地识别和切割特定DNA序列。通过设计ZFNs可以在外源基因启动子上切割，诱导基因过表达。

2. 转录激活样效应物（TALENs）：类似于ZFNs，但TALENs的靶向序列更长，特异性更高。

RNA干扰（RNAi）

1. 小干扰RNA（siRNA）：通过敲低内源性基因的表达来间接使相关基因过表达。siRNA与内源性mRNA互补结合，通过RISC复合体将其降解，从而抑制基因表达。

2. 短发夹RNA（shRNA）：将shRNA序列克隆到质粒载体中，转染入细胞后可以产生siRNA，达到敲低内源性基因表达的效果。

CRISPR-Cas9

1. 基因编辑：CRISPR-Cas9系统可以特异性切割DNA序列。通过设计导向RNA（gRNA），CRISPR-Cas9可以切割外源基因启动子区域，诱导基因过表达。

2. 激活转录：除了基因编辑功能外，CRISPR-Cas9还可以被用于激活转录。通过将Cas9连接到转录激活因子，CRISPR-Cas9可以靶向外源基因启动子区域并激活基因表达。

2、基因过表达载体构建基本步骤

基因过表达载体构建的基本步骤

1. 确定目标基因

确定需要过表达的目标基因，可以在公开数据库中搜索或通过文献研究确定。

2. 克隆目标基因

从已有的克隆库或通过 PCR 从 cDNA 文库扩增目标基因，将扩增产物克隆进载体中，如质粒或慢病毒载体。

3. 构建表达载体

选择一个合适的表达载体，该载体包含以下元件：

启动子：启动基因转录。

转录终止序列：终止基因转录。

抗生素抗性标记：用于筛选包含载体的细胞。

选择性标记：用于筛选过表达基因的细胞。

4. 连接表达盒

将克隆化的目标基因片段连接到表达盒中，表达盒包含启动子和转录终止序列。

5. 转染载体

将构建好的载体转染到靶细胞中，可以使用转染试剂、电穿孔或病毒介导的转染方法。

6. 选择性和筛选

使用选择性标记来选择过表达目标基因的细胞，例如抗生素抗性或荧光报告基因。

7. 验证过表达

通过 RT-qPCR、蛋白质印迹或其他方法验证过表达基因的表达水平，以确保成功过表达。

3、使基因过表达的方法有哪些

使基因过表达的方法

基因过表达是指人为增加特定基因产物的表达水平的技术。这对于研究基因功能、调节细胞行为以及治疗疾病至关重要。以下是一些常用的使基因过表达的方法：

1. 转染法

转染法利用病毒或非病毒载体将外源基因导入靶细胞。病毒载体，如腺病毒或逆转录病毒，具有感染细胞并将遗传物质整合到细胞基因组的能力。非病毒载体，如脂质体或聚合物，与外源基因结合并介导其进入细胞膜。

2. 质粒转染

质粒是一种小环状DNA分子，可以携带外源基因。质粒转染涉及将质粒引入靶细胞，使用电穿孔或化学转化剂等技术。一旦进入细胞，质粒可以通过转录和翻译产生外源基因产物。

3. 基因敲入

基因敲入通过同源重组将外源基因整合到靶基因中。使用设计成与靶基因具有同源性的载体，可以将外源基因置换或插入靶基因。这种方法允许在基因的天然位点实现受控的基因过表达。

4. CRISPR-Cas系统

CRISPR-Cas系统是一种强大的基因组编辑工具，可用于靶向基因并激活其表达。通过设计单向导RNA (sgRNA)，可以引导Cas9核酸酶切割靶基因附近的DNA。这通常会导致细胞修复机制插入外源DNA模板，其中包含驱动基因过表达的调控元件。

5. 转基因动物模型

转基因动物模型涉及将外源基因引入受精卵或胚胎干细胞。一旦外源基因整合到动物的基因组中，它们就会在整个动物的生命周期中稳定表达。这种方法对于研究基因过表达对发育、疾病和行为的影响至关重要。